使用激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）拍攝合格的照片，需要遵循一系列步驟和技巧。以下是一些關鍵的步驟和注意事項：

一、樣品準備

樣品固定與染色：

確保樣品經(jīng)過適當?shù)墓潭ê腿旧?，以增強對比度和熒光信號?/span>

對于組織切片，控制切片的厚度以獲得Z佳的成像效果，通常待測樣品Z大厚度為1~2mm。

樣品封片：

蓋玻片厚度應小于0.17mm，滑塊厚度為0.8~1.2mm。

固定或活的貼壁細胞應當培養(yǎng)在共聚焦專用培養(yǎng)皿或蓋玻片上；懸浮細胞甩片或滴片后，用蓋玻片封片，封片劑多采用甘油和PBS（pH 8.5~9）混合液（甘油:PBS=9:1）。

二、激光共聚焦顯微鏡設置

激光強度：

根據(jù)樣本的熒光特性調(diào)整激光強度，避免過度激發(fā)導致的光漂白。

激光強度的增強是用更高能量的激發(fā)光去激發(fā)熒光信號。

檢測器電壓：

檢測器光電倍增管可以把光子信號轉化為電信號并放大信號，具有極高的靈敏度和較低的噪音。

增加光電倍增管的電壓值可放大信號，提高成像亮度。但是檢測器的信號放大有一定限度，當電壓值超過一定閾值檢測器噪音大幅度增加，會導致成像模糊。

圖片亮度和背景：

成像圖片的亮度和背景都是數(shù)字信號的改變，可以增加成像的對比度，但對成像分辨率沒有改變。

避免圖像過曝，過曝的成像片子存在熒光定量分析不準的問題。

掃描速度和平均次數(shù)：

根據(jù)需要的圖像分辨率和采集速度選擇合適的掃描速度。較低的掃描速度可以提高圖像質量，但會增加采集時間。

適當增加平均次數(shù)（拍攝多張取平均值）可以提高信噪比，改善圖片的清晰度。

掃描分辨率：

采樣分辨率的大小直接決定是否能達到儀器的光學分辨率極限和Z終成像圖片的清晰度。

常規(guī)圖片采集推薦使用系統(tǒng)默認的采樣分辨率，也可根據(jù)需求適當調(diào)整。

三、拍攝技巧

選擇合適的物鏡：

為快速、準確找到標本、觀察和成像，一般采用由低到高變更物鏡（10倍→20倍→40倍/60倍）。

使用40倍物鏡時，需在鏡頭中央滴加適量蒸餾水；使用60倍物鏡時，需在鏡頭中央滴加適量共聚焦專用鏡油。

調(diào)節(jié)針孔參數(shù)：

薄標本（如活細胞）需適當增大針孔參數(shù)，從而有效保護標本，提高亮度，得到反差更好的圖像。

厚標本（如厚組織切片）則需適當減小針孔參數(shù)，從而獲得更薄、更準確、更精細的圖像。

使用自動拼接功能：

當樣品圖像的比例遠超出顯微鏡的成像范圍時，可以使用自動拼接功能生成高質量的大尺寸照片。

四、其他注意事項

定期校準：

定期校準激光器和物鏡，確保激光的穩(wěn)定性和準確性以及物鏡的清潔度，以獲得Z佳的成像質量。

防光漂白：

使用抗光漂白劑，如DABCO或N-propyl gallate，以減少熒光信號的衰減。

軟件更新與維護：

保持軟件的Z新版本，以獲得Z佳的性能和功能。

按照制造商的指南進行定期維護，包括清潔光學元件和更換消耗品。

生物安全與數(shù)據(jù)管理：

對于涉及生物樣本的實驗，遵守相關的生物安全和倫理規(guī)定。

確保數(shù)據(jù)的管理和存儲符合科研誠信和隱私保護的要求。

遵循以上步驟和技巧，結合實踐中的不斷摸索和優(yōu)化，可以使用激光共聚焦顯微鏡拍攝出合格且高質量的照片。