激光共聚焦顯微鏡對于樣品的要求及制備方法因樣品類型的不同而有所差異。以下是對不同類型樣品的要求及制備方法的詳細介紹：

一、樣品要求

生物樣品

熒光表達：對于需要觀察熒光標記的樣品，應先在熒光顯微鏡下觀察熒光表達是否正常，以確定是否有必要使用激光共聚焦顯微鏡。

蓋玻片厚度：蓋玻片的厚度要求≤0.17mm，以確保成像質量。

激發(fā)/發(fā)射波長：明確樣品的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以便選擇合適的激光器進行成像。

掃描參數：對于需要重構的樣品，應明確掃描區(qū)域大小、位置以及Z步進等參數，這些參數會影響測試時間。

樣品固定：共聚焦的標本B須貼壁良好，不能懸浮起來。樣品需要在載玻片上固定好后送樣測試。

抗熒光淬滅劑：做顯微成像時，樣品需要加抗熒光淬滅劑，并固定蓋玻片。

材料樣品

樣品制備：主要測試偏材料的樣品，樣品應提前制備好。

尺寸與顏色：拍出來*大面積為1.11×1.8mm到5×5mm范圍內，顏色可調。樣品的尺寸沒有具體要求，但B須平整。

二、制備方法

組織切片樣品

組織采集與固定：

采用液氮冷凍法或多聚甲醛（PFA）固定法采集和固定組織。

液氮冷凍法：將新鮮組織放入液氮中保存。

多聚甲醛固定法：將組織塊置于4%PFA中進行后固定，時間根據組織塊大小和致密程度調整。

冷凍包埋與切片：

使用冷凍切片機將組織切成5~15μm的切片。

冷凍方法包括氣體CO2冷凍包埋法、干冰冷凍包埋法、液氮冷凍法和直接冷凍法。

免疫熒光標記：

將冷凍組織切片進行免疫熒光抗體標記。

使用熒光顯微鏡觀察標記是否成功，然后移至激光共聚焦顯微鏡進行掃描成像。

細胞培養(yǎng)樣品

熒光表達載體的構建與導入：

構建綠色熒光融合蛋白表達載體，并將其導入到培養(yǎng)細胞中。

常用的轉染方法有磷酸鈣轉染法和脂質體介導的轉染法。

細胞培養(yǎng)與轉染：

將培養(yǎng)的細胞鋪在含有玻璃片的細胞培養(yǎng)皿中。

在轉染細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)1~2天，使GFP標記的蛋白表達水平達到能被熒光顯微鏡檢測的水平。

免疫熒光染色：

使用預冷的PBS緩沖溶液洗滌細胞，去除殘留的培養(yǎng)液。

加入4%多聚甲醛（PFA）固定液進行固定。

使用Triton X-100處理細胞，通透細胞膜。

在含有1%BSA的PBS溶液中孵育細胞，封閉細胞和玻璃片。

加入一抗和二抗進行結合，并使用熒光標記的染料進行染色。

*后使用封片劑封片，準備進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

三、其他類型樣品的制備方法

菌液/污泥/污水類樣品：

離心得到菌體沉淀，根據需要進行死活染色或ROS染色。

樣品需加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

生物膜樣品：

樣品表面應平整，標出拍攝面。

加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

若在爬片上培養(yǎng)生物膜，可將爬片粘于培養(yǎng)皿底部，充滿培養(yǎng)基后封口膜密封保存。

植物類樣品：

可進行簡單冰切及刀切處理。

加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

與細胞共培養(yǎng)的樣品：

根據樣品類型和與細胞的作用方式確定送樣量和制樣要求。

提供清楚激發(fā)/發(fā)射波長、拍攝類型（2D/3D）、拍攝倍數等要求。

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡對于不同類型樣品的要求及制備方法有所不同。在制備樣品時，應根據樣品的類型和實驗需求選擇合適的方法和步驟進行操作。